NY_T 2840-2015 猪细小病毒间接ELISA抗体检测方法
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ID： |
3D9D0105E0804DAFA94E293F71629661 |
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文件大小(MB)： |
0.42 |
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8 |
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文件格式： |
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日期： |
2024-8-14 |
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ICS 11.220,B41 NY,中华人民共和国农业行业标准,NY/T 2840—2015,猪细小病毒间接ELISA抗体检测方法,Indirect ELISA for detection of antibodies against,Porcine parvovirus,201570-09 发布2015-12-01 实施,中华人民共和国农业部发布,ny/t 2840—2015,刖 百,本标准按照GB/T 1.1—2009给岀的规则起草,本标准由中华人民共和国农业部提出,本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC 181)归ロ,本标准起草单位:中国动物卫生与流行病学中心,本标准主要起草人:陈义平、南文龙、周洁、陆明哲、魏荣,I,NY/T 2840—2015,猪细小病毒间接ELISA抗体检测方法,1范围,本标准规定了细小病毒科细小病毒属的猪细小病毒抗体的间接ELISA检测方法,本标准适用于猪细小病毒抗体监测以及流行病学调查,2规范性引用文件,下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文,件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件,GB/T 6682分析实验室用水规格和实验方法,GB 19489实验室生物安全通用要求,GB/T 27401实验室质量控制规范动物检疫,中华人民共和国农业部公告〔2003〕第302号 兽医实验室生物安全技术管理规范,3缩略语,下列缩略语适用于本文件:,PPV:猪细小病毒 Porcine parvovirus,ELISA:酶联免疫吸附试验 Enzyme - linked immunosorbent assay,OD:光密度 optical density,r/min:转/分钟 rotations per minute,4试剂,4. 1猪细小病毒VP2重组蛋白（re-VP2）,克隆猪细小病毒结构蛋白VP2抗原优势区基因,用PET-32a表达载体进行原核表达,亲和层析法,纯化重组蛋白。获得的重组蛋白浓度应三1 mg/mL,纯度应ミ95%。具体过程见附录A,4.2 阳性血清对照,选取5月龄健康猪2头,用猪细小病毒疫苗按规定剂量进行免疫,间隔3周免疫2次,第二次免疫1,个月后开始采血分离血清,用血凝抑制试验测定其抗体效价。当抗体的血凝抑制效价达到1 ： 1 024时,釆血分离血清,将血凝抑制效价为1 ： 1 024的阳性血清用样品稀释液（参见B. 4）进行1 ： 50稀释,即为,阳性血清对照,4.3 阴性血清对照,采集无母源抗体、未免疫猪细小病毒疫苗的健康猪血清,经血凝抑制试验检测,结果为猪细小病毒,抗体阴性,用样品稀释液（参见B. 4）进行1 ： 50稀释,即为阴性血清对照,4.4 包被液、洗涤液、封闭液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、底物显色液、终止液配制方法分别见B. 1、,B. 2、B. 3、B. 4、B. 5、B. 6、B. 7,5器材和设备,一次性注射器、恒温培养箱、震荡混匀仪、移液器（200 に、1 000 *L）、多道移液器（200 ”J、酶标板、,酶联免疫检测仪等,1,NY/T 2840—2015,6血清样品的处理,6. 1血清样品的采集和处理,静脉采血,每头猪不少于2 mL0血液凝固后分离血清,4 000 r/min离心10 min,用移液器吸出上层,血清,6.2血清样品的储存和运输,血清样品置ー2。℃以下冷冻保存。运输时确保低温运送,并及时送达,以防血清样品腐败。按照中,华人民共和国农业部〔2003〕第302号公告的规定进行样品的生物安全标识,7间接ELISA抗体检测操作方法,7. 1包被抗原,以纯化的猪细小病毒VP2重组蛋白（re - VP2）作为包被用抗原,将重组蛋白re - VP2用包被液稀,释至3 jzg/mL,每孔加入100 （每孔抗原包被量为300 ng）,371包被2 h,用洗涤液洗板3次,每次,5 min 〇,7.2 封闭,每孔加入200丛1封闭液,37℃封闭2 h,洗板同上,7.3 加待检血清及阳性血清对照、阴性血清对照,将待检血清用样品稀释液进行1 ： 50稀释,每孔加入100トレ每板同时设置两孔阳性血清对照、两,孔阴性血清对照。当待检血清样品较多时,可根据试验进度,提前进行样品稀释,再ー并加样,以确保所,有待检样品的反应时间准确、一致。37℃作用1 h,洗板同上,7.4 加酶标抗体,将兔抗猪酶标抗体用酶标抗体稀释液稀释至工作浓度,每孔加入100产L,37℃作用1 h,洗板同上,7.5 加底物显色液,每孔加入100 底物显色液,37℃避光显色作用10 min,7.6 加终止液,每孔加入100 aL终止液终止反应,10 min之内测定OD45。值,7.7 结果判定,在酶联免疫检测仪上读取OD45。值,计算阳性血清对照。ユ5。平均值ODp、阴性血清对照ODI5。平均,值06。阳性血清对照OD45。平均值ODp20. 5,阴性血清对照0ロ5。平均值0600. 2时,试验成立,待检血清样品的。D丒。N。.2XODp+0. 8义0ス判为阳性,反之判为阴性,8注意事项,8. 1相关试剂需在2℃.保存,使用前平衡至室温,8.2 操作时,注意取样或稀释准确,并注意更换吸头,8.3 底物溶液避光保存,避免与氧化剂接触,8.4 终止液有腐蚀作用,使用时避免直接接触,8.5 废弃物处理参照中华人民共和国农业部〔2003〕第302公告的规定进行,2,ny/t 2840—2015,附录A,(规范性附录),猪细小病毒VP2蛋白的表达及纯化,A. !材料和试剂,猪细小病毒NAD……
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